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先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)为最常见的出生缺陷,是指由心脏或大血管的结构发育不良引起的心功能障碍[]。CHD可影响大约1%的活产儿,已成为导致儿童死亡的主要原因[]。目前CHD病因及发病机制尚未完全明确,普遍的观点认为其与多种遗传和环境因素有关。在妊娠期心脏及大血管形成的关键时期(第3~8 周),环境因素对胎儿的影响最大,易导致胚胎发育畸形[]

锌(zinc, Zn)是胎儿心脏正常发育所必需的微量元素,参与细胞代谢、抗氧化和抗炎等许多过程,并参与基因表达的调节和蛋白质、糖类、脂肪的代谢[]。锌缺乏或者锌过量均会对健康产生不良影响。锌缺乏会导致免疫力降低[]、胎儿生长受限[]以及先天畸形[]。虽然已知锌的毒性低于汞、铅、砷和镉等其他金属,但是锌过量后会产生急性和慢性毒性反应[]。过量的Zn2+摄入会促进呼吸窘迫综合征[],也会降低大鼠的生殖能力[10]。此外,过量摄入Zn2+可能会促进Cu2+和Fe2+缺乏,从而导致生长不良和贫血[11]。一些研究证据表明,人类使用锌补充剂,即使在一个相当低的浓度,也可能产生不良后果[12]

关于锌暴露水平对人类CHD发病影响的临床证据较少,有研究报告锌水平与室间隔缺损的发生呈负相关[13],而另一项研究未发现锌水平与CHD及其亚型发病相关[14],甚至有一项研究发现在CHD病例中锌水平高于健康对照组[15]。鉴于锌对心脏发育的重要性,本研究拟进一步评估孕母和新生儿锌暴露水平及其与新生儿CHD发病的潜在风险,以期为CHD的治疗提供理论依据。

1   材料与方法

本研究是基于2010—2012年在甘肃省妇幼保健院进行的兰州出生队列的巢式病例对照研究,具体纳入与排除标准见文献[1617]。由经过培训的访调员对符合出生队列纳入标准的孕妇分别在孕早期、孕中期、孕晚期及产后42 d进行问卷调查。收集有关人口统计、病史、居住史、吸烟和饮酒、职业、营养补充和饮食等方面的详细信息,并从医疗记录中提取其出生结局信息。该项队列研究纳入研究对象14359名,共有10542名孕妇(73.42%)完成了问卷调查。本研究在排除多胞胎、死胎和其他出生缺陷(非CHD)后,从其中10 087例单胎活产的新生儿中收集到罹患CHD者97名作为CHD组,并从数据库中按照其母亲年龄、地域进行1∶2配对选择出生后身体健康的新生儿作为对照。病例纳入标准:出生后经超声心动检查诊断为CHD并在42 d后随访时仍明确诊断为CHD的患儿,由两个资深儿科医师双核实诊断。根据国际疾病与分类标准第10版(ICD-10)对疾病进行编码。纳入本次研究的对照组均为足月儿,CHD组有29例早产儿。本研究通过甘肃省妇幼保健院伦理委员会的审批,批号:(2021)GSFY伦审 [09] 号,并获得了孕妇的书面知情同意。

于孕28周至分娩之前留取孕母静脉血,并在分娩时留取新生儿脐静脉血4 mL装入EDTA抗凝管,混匀并分装保存于−80 ℃冰箱。在测量之前,所有血液样品均在室温下完全融化。在中科院兰州分院化学物理研究所的实验室使用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)(iCAP RQ,赛默飞世尔科技,美国)测量血液中的锌质量浓度(后称浓度)。血液前处理采用微波消解法。精确量取200 μL的解冻全血样品放入四氟内胆中,加入68% HNO3 1 mL(摇匀)、40% H2O2(电子级)200 μL,待聚四氟乙烯溶样内胆中的气泡完全消失以后,加盖及钢套密闭,放入烘箱中在175 ℃保持6~8 h。冷却后,将提取液转移至10 mL的试管中,用去离子水稀释至10 mL摇匀后待上机测定。仪器检测之前至少开机6 h(保证真空),先使用质谱调谐液在标准模式下对仪器的灵敏度、双电荷等进行调谐,达到检测要求,调谐通过后保存,再进行碰撞+动能歧视模式下的调谐,指标合格后方可进行元素检测。ICP-MS的测量条件:射频功率为1550 W,冷却气流速为13.84 L·min−1,辅助气流速为0.795 L·min−1,载气流速为0.93 L·min−1,碰撞气流速为4.79 L·min−1,采样深度为5 mm,重复3次,停留0.05 s。

应用 EpiData 3.1软件建立数据库,由专人经培训后进行双人平行录入数据,统计分析采用SPSS 26.0软件。计数资料使用χ2 检验进行比较。偏态分布计量资料采用中位数M和第25、75百分位数(P25P75)进行统计学描述,组间比较采用 Wilcoxon-Mann-Whitney U检验。使用本研究中对照组孕母全血和新生儿脐血锌浓度的P25P75进行划分,以中暴露水平P25~P75为参考标准,低于P25为低暴露水平,高于P75为高暴露水平。以是否患CHD为应变量,锌暴露水平和新生儿体重以哑变量形式纳入模型(从临床意义考虑,极微量锌暴露水平的差异不会造成临床表型的差异,所以将体重按照临床诊断标准分为低出生体重、正常体重和巨大儿来分析),调整孕母孕早期阴道流血、孕前补充叶酸和维生素、新生儿体重和脐绕颈混杂因素后,采用二元多因素条件logistic 回归模型分析孕母和新生儿锌水平与新生儿CHD发病风险之间的关联。检验水准α=0.05。

2   结果

孕母和新生儿的一般特征在CHD组与对照组分布见表1。CHD组和对照组孕母孕早期阴道流血、孕前补充叶酸和维生素、新生儿体重和新生儿脐绕颈分布差异具有统计学意义(均P<0.05),其他变量两组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

孕母全血锌检出率为100.00%。CHD组和对照组孕母全血锌浓度的MP25P75)分别为5.034(3.456,6.644)mg·L−1和4.693(3.411,5.646)mg·L−1,两组差异具有统计学意义(P=0.029)。CHD组新生儿由43例一种心脏畸形的单纯型CHD和54例复杂型CHD(即合并两种或两种以上心脏畸形)组成。亚组分析显示,单纯型CHD组孕母全血锌浓度高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.039)。见表2

新生儿脐血锌检出率为100.00%。新生儿脐血锌浓度的MP25P75)在CHD组为2.153(1.479,2.405)mg·L−1,在对照组为1.636(1.304,1.979)mg·L−1,两组差异具有统计学意义(P<0.001)。亚组分析显示,单纯型CHD和复杂型CHD新生儿脐血锌浓度与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2

表3显示未校正和校正的孕母锌水平与子代CHD发病的关系。根据对照组孕母全血锌浓度的四分位数P25P75将其分为低、中、高三组,以中暴露水平(3.41~5.65 mg·L−1)为参考标准,小于3.41 mg·L−1为低暴露水平,大于5.65 mg·L−1为高暴露水平。经调整混杂因素后,结果显示,在该孕母人群的锌暴露水平下,与中等锌暴露水平相比,高锌暴露水平的孕母其子代CHD发病风险为2.225倍(OR=2.225,95%CI:1.017~4.868)。但未观察到孕母低锌暴露水平与子代CHD的发病有相关性。亚组分析显示,高锌暴露水平孕母较中等暴露水平者,其子代单纯型CHD发病风险增高(OR=4.081,95%CI:1.427~11.669)。

表4显示未校正和校正的新生儿脐血锌水平与其CHD发病的关系。根据对照组新生儿脐血锌浓度的四分位数P25P75将其分为低、中、高三组,以中暴露水平(1.30~1.98 mg·L−1)为参考标准,小于1.30 mg·L−1为低暴露水平,大于1.98 mg·L−1为高暴露水平。校正混杂因素后,在该新生儿人群的锌暴露水平下,与中等锌暴露水平相比,高锌暴露水平的新生儿CHD发病风险升高到4.132倍(OR=4.132,95%CI:1.801~ 9.480)。但未观察到新生儿低锌暴露水平与新生儿CHD的发病有相关性。亚组分析显示,高锌暴露水平的新生儿发生单纯型CHD(OR=7.122,95%CI:2.126~23.854)和复杂型CHD(OR=5.165,95%CI:1.859~14.346)的风险均增高。

3   讨论

本次研究通过一项基于出生队列的巢式病例对照研究评估了孕母和新生儿锌水平与新生儿CHD发病的相关性,结果发现在本人群的暴露水平下,与中等锌暴露水平相比,孕母和新生儿高锌暴露水平可能增加新生儿CHD的发病风险。

锌是大约200种酶的辅助因子,包括金属蛋白酶、转移酶、 磷酸酶和氧化还原酶等,对免疫系统和生物体抗氧化功能有显著影响[18]。锌作为一种必需的微量营养素,世界卫生组织估计每天男性(64 kg)生理需要吸收的锌为1.97 mg,女性(55 kg)为1.54 mg。怀孕和哺乳女性对锌每天的需求量分别增加到2.27和2.89 mg[19]。研究显示孕母血清锌和新生儿脐血锌含量存在正相关关系[20],这主要与锌通过胎盘活性氨基酸的主动转运有关[21]。由于地域和种族差异,孕母全血和脐血锌的正常参考范围目前还没有统一的标准。本研究中对照组孕母孕晚期全血锌的中位数水平低于Bocca等[22]的检测结果(6.708 mg·L−1) ,高于Callan等[23]的检测结果(2.33 mg·L−1);对照组新生儿脐血锌的含量较Bocca等[22]研究结果(2.311 mg·L−1)偏低,但高于Kopp[24]等的报道数据(1.34 mg·L−1)。本研究孕母血液样本采自孕晚期,存在随孕期血容量扩增导致元素浓度降低的现象[25]

动物研究表明,锌缺乏和锌暴露过量均可引起胚胎的心肌细胞发生形态学的异常改变,从而导致心脏畸形的发生[2627]。本研究显示CHD组孕母全血和新生儿脐血锌水平高于对照组,与Dilli等[15]的研究结果类似,其通过对108例CHD新生儿和103名健康新生儿及其母亲孕早期血清叶酸、锌(该研究中唯一的金属元素)、维生素等指标比较分析发现,与对照组相比,CHD组孕母和新生儿血清锌水平均增高。Kundak等[28]研究观察到有锥体缺陷的CHD新生儿胎粪中的锌含量高于正常新生儿。既往对于孕母全血锌水平对子代CHD影响的研究结论尚不一致。Moghimi等[]的研究表明,血清锌水平降低的母亲,其子代先天畸形的发生风险是血清锌正常母亲的7倍多。本研究在排除混杂因素后,发现孕母和新生儿高锌暴露是新生儿CHD发病风险增加的危险因素。关于脐血锌水平与CHD的相关性尚未见报道。这些研究发现的不同可能是研究设计、暴露评估方法、研究人群、孕期锌暴露水平以及检测样本不同所导致。其中,孕期锌暴露水平和检测样本差异可能更为重要。例如有研究发现孕母孕早期和孕晚期的血液和尿液样本的锌水平有差异[22]

锌进入人体的途径主要有以下三种:吸入、皮肤接触或摄入,每种暴露途径都会影响身体的特定部位,吸收不同量的锌[29]。新生儿锌主要还是依靠孕母在孕期摄入较多含锌食物和维生素并通过胎盘主动转运,但是环境中锌对其水平影响尚不明确。目前对锌与CHD发病的生物学机制尚未明晰。一般来说,锌是一种无毒元素,然而胚胎发育过程中过量的锌可能会致畸或致命[30]。在大鼠中,锌盐的口服半数致死量为237~ 623 mg·kg−1,在人类饮水或食物中大约325~650 mg的锌会出现急性毒性反应,导致恶心、腹部绞痛、呕吐、里急后重和伴有或不伴有出血的腹泻[31]。据报道,含有水溶性锌的颗粒物肺暴露后会产生心脏损伤,心脏组织基因表达谱分析表明其损伤机制涉及线粒体、Ca2+ 稳态、细胞信号传导、钾/钙和钠通道的基因以及转移酶的变化,提示锌暴露会直接作用于心脏[32]。除此之外,金属元素之间会有相互作用,如锌和铜[33]、锌和镉[34]等。孕母和新生儿可能以某些方式暴露于多种金属,在发病机制中协同作用。金属元素的累积效应会使新生儿在发育过程中发生DNA甲基化,而DNA甲基化调节与心脏发育相关的重要基因,异常DNA甲基化可能会导致CHD[35]

本研究的优点如下 :首先,这是一项基于出生队列的巢式病例对照研究,可以为孕母和新生儿锌水平与CHD的发病提供更充分的证据;其次,通过详细的问卷调查,充分控制了潜在的混杂因素。本研究的局限性在于:所有参与者都是从一家医院招募的,这可能会存在一定的选择偏倚;此外,由于目前还未建立本检测方法下的针对孕母全血和新生儿脐血锌元素的统一参考范围,且血液锌浓度主要依赖于机体血液流通的瞬时状态和新陈代谢[36],尚不能明确孕母和新生儿锌暴露的程度或实际锌过量或缺乏的程度;本研究的样本量少,不足以确定孕母和新生儿锌水平的安全阈值;同时,本研究分析了孕晚期孕母全血锌水平变化,但未测定孕早期、孕中期全血锌水平,且没有获得来自所有研究者孕期关于锌摄入和补充方面信息,无法进一步分析孕母锌水平对新生儿锌水平的影响;本研究没有分析锌以外的其他金属元素、环境有害因素以及遗传因素与CHD之间的关联,而这些因素可能也会对结果有影响。

综上所述,本研究通过一项基于出生队列的巢式病例对照研究,发现孕母和新生儿相对高浓度的锌水平可能与新生儿CHD发病有关。建议孕母孕期合理控制锌的摄入,从而促进优生优育。然而,鉴于本研究可能存在研究对象的选择偏倚以及难以明确本人群具体暴露水平等问题,还需要更多的研究来进一步探讨孕母和新生儿体内锌水平与新生儿CHD的发病关系,并阐明其中的生物学机制。

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